1、細胞復蘇

將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。將融化的細胞移入離心管中，加入37℃預熱的DMEM*培養基中（其中胎牛血清約為10%），輕輕吹勻，離心，500g離心2min，棄上清液。

加入DMEM*培養基清洗，棄上清液。加入DMEM*培養基，輕輕吹打混勻，制成細胞懸液，接種于培養皿/瓶中，在含5% CO2的細胞培養箱中培養。

2、細胞傳代

當細胞密度達到80%~90%（過(guò)早產(chǎn)量不足，過(guò)晚細胞狀態(tài)不佳，1:2至1:10以上的比率傳代培養，一般1:3至1:5細胞一代，即從細胞接種到分離再培養的一段時(shí)間，非細胞有絲分裂次數）時(shí)，去掉*培養基，用1X PBS清洗2次。

加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以蓋住細胞，消化溫度是37℃。顯微鏡下觀(guān)察細胞：倒置顯微鏡下觀(guān)察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細胞消化適度）進(jìn)行消化，放入細胞培養箱中約2-3min。

加入適量DMEM*培養基終止胰蛋白酶消化，轉移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM*培養基清洗，棄上清液。

加入DMEM*培養基，輕輕吹打混勻，吸取10微升進(jìn)行計數，然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養箱繼續培養。

3、細胞凍存

當細胞密度達到80%~90%時(shí)，去掉*培養基，用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，放入細胞培養箱中約2-3min。加入DMEM*培養基終止胰蛋白酶消化，轉移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM*培養基清洗，棄上清液。加入lml凍存液（90%胎牛血清，10%DMSO。 一般來(lái)講血清含量可以在10%-90%之間調整，凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營(yíng)養，另一方面可以在細胞凍存過(guò)程中提供非滲透性保護物質(zhì)，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護細胞），放入凍存管內（管內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入4℃冰箱中凍存30min，然后放入-20℃冰箱中凍存30min，再置于-80℃冰箱內過(guò)夜。

第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個(gè)月。

細胞凍存和復蘇的原則是：慢凍速融，這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑，會(huì )導致細胞內冰晶的產(chǎn)生，從而使細胞產(chǎn)生內源性的機械損傷，引起細胞內環(huán)境滲透壓，PH，電解質(zhì)等的改變，進(jìn)而促使細胞死亡。